Existen indicios de la presencia de seres humanos antes de la conquista y el surgimiento del imperio incaico, ya que se han encontrado restos antiquísimos como los petroglifos en los ríos de Palotoa (Petroglifos de Pusharo), Shinkebenia y Urubamba. En la cordillera de Pantiacolla, en las cabeceras de Madre de Dios, también hay petroglifos y restos antiguos que atraen a los arqueólogos. Se estima que las primeras poblaciones de Madre de Dios debieron aparecer hace miles de años y se cree que los arahuacos o sus antecesores, los proto arahuacos, llegaron vía migración, derivándose a partir de ahí muchas etnias, relacionándose posteriormente con los incas y los españoles. Algunas tribus como los Machiguengas, sobreviven hasta nuestros días.
Lo que hoy se conoce como Madre de Dios, formaba parte del antiguo imperio incaico, en la región conocida como Antisuyo. Sin embargo poco es lo que se sabe de su formación con exactitud. Inclusive, algunas crónicas del Inca Garcilazo de la Vega han sido puestas en tela de juicio por los datos contradictorios que existen. Sin embargo, los historiadores coinciden que la conquista de esta región fue difícil para los incas pues debieron enfrentar a tribus aguerridas y conocedoras de la zona que diezmaron a diferentes ejércitos conquistadores. Durante la colonia se realizaron expediciones con resultados trágicos para los aventureros quienes murieron a manos de las diferentes tribus. Recién en 1567, al mando de 250 hombres, Juan Alvarez Maldonado llega bastante cerca a lo que hoy es Madre de Dios. Posteriormente, en 1861, el coronel Faustino Maldonado la recorre en su real magnitud llegando al límite con Brasil.
